Western blotting堪称蛋白质研究中的经典方法。学生物的几乎无人不晓,即使没亲手做过,也清楚其原理。经典果然是经典,30年来其操作步骤几乎没变过,依然是跑胶-转膜-封闭-孵育-检测。近两年,各大公司陆续推出了Western blotting方面的新仪器,如新型转印系统,确实能省时省力不少,但仍然不能完全克服研究人员在今天面临的挑战。Western blotting仍存在重复性差、实验耗时长、无法准确定量等问题。
近日,美国proteinsimple公司推出了一种Simple Western™分析,彻底改变了整个Western blot。此分析在一台名为Simon的仪器上开展,Simon将所有实验步骤自动化,包括蛋白上样和分离、免疫印迹、洗涤、检测以及数据的定量分析,让研究人员从繁重的劳动中解放出来,同时避免了可能影响实验重复性的人为因素。
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无需凝胶、无需转印,放入您的样品,按个按钮,然后就没事了。几个小时之后,完全分析好的结果正等着你呢,一切听上去是不是有点不可思议?那么让生物通小编带你看看Simon是如何工作的。
首先,将样品与Simple Western样品缓冲液混合,至终浓度1 μg/μL,还原并变性,然后将制备好的样品、一抗和二抗、化学发光底物分配到384孔分析板的指定孔中。之后,将Simple Western分析缓冲液、毛细管和制备好的分析板放入Simon内,它自动开展所有分析步骤。
当蛋白沿着毛细管内一个堆积和分离基质迁移时,它们分离。分离后的蛋白固定到毛细管壁上。之后利用一抗鉴定目标蛋白,用HRP结合的二抗和化学发光底物检测蛋白。系统自动报告检测蛋白的分子量和信号。每次实验可同时分析最多12个样品,结果可在3-5小时内获得。15-150 kDa的目标蛋白均可检测。软件报告每个检测蛋白的分子量、面积、面积百分比和信噪比。
对于传统的Western blot而言,结果的重复性一直是个挑战,因为缺乏标准化的操作,且多个操作步骤引入了实验可变性。而Simple Western分析是完全自动化的,因此结果的重复性更好。整体的定量也大大改善了,因为省去了转印步骤,从而避免了蛋白转移的不一致。
有了Simple Western,Western真的简单了。你可以省下大量时间,干更有意义的工作,同时获得重复性更好的半定量Western blot结果。